Growth kinetics of of Bacillus thuringiensis. Bath fet-bath and continuous bioreactor cultures - Rivera David; The University of Western Ontario
Las cľulas de Bacillus thuringiensis, durante su fase tarda̕ de crecimiento estacionario, producen tanto esporas como la proten̕a cristal bioinsecticida delta-endotoxina. Las cľulas de B. thuringiensis tambiň se desarrollan dependiendo de las condiciones ambientales. As,̕ es necesario adoptar un enfoque extenso para estudiar la cinťica de crecimiento de B. thuringiensis considerando, no solamente el crecimiento celular tp̕ico, sino los cambios metabl̤icos que ocurren mientras se producen las esporas y la proten̕a cristal.Este documento presenta los resultados del estudio de cinťica de crecimiento celular de B. thuringiensis, subespecies kurstaki, cepa HD-1 (ATCC 33679), puesta a crecer bajo condiciones de crecimiento batch (por lotes) y fed-batch (por lotes alimentado). Adicionalmente, se investig ̤el crecimiento del B. thuringiensis bajo condiciones de estado estacionario continuo en un sistema de biorreactor de 2 L de una etapa y un sistema de biorreactor continuo de dos etapas, el cual consista̕ en un reactor de 2 L seguido de otro de 15 L.La microscopa̕ p̤tica y la microscopa̕ de transmisin̤ de electrones (TEM) se emple ̤extensivamente en este estudio para medir la morfologa̕ y el estado metabl̤ico de las cľulas de B. thuringiensis a diferentes condiciones de crecimiento durante los experimentos batch, fed-batch y continuos en estado estacionario. Se observaron diferencias morfolg̤icas significativas en las cľulas de B. thuringiensis, como una funcin̤ del tiempo de crecimiento para los experimentos batch, y como funcin̤ de las velocidades de difusin̤ para los experimentos continuos en estado estacionario.La separacin̤ de la proten̕a cristal a partir del caldo fermentacin̤ para props̤itos analt̕icos present ̤serios problemas. Es este estudio, se desarroll ̤un nuevo mťodo para aislar la proten̕a cristal, el cual la produca̕ con una pureza superior al 95% ł 5%. Adicionalmente, se emple ̤Cromatografa̕ Lq̕uida de Alto Desempeǫ (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) para detectar la proten̕a. Los resultados experimentales demostraron la alta dependencia de la formacin̤ de esporas y proten̕a cristal con respecto al tipo de cultivo. En los cultivos batch, la formacin̤ de esporas y proten̕as cristal caus ̤un decrecimiento en la velocidad de crecimiento de la biomasa, reduciendo la concentracin̤ de biomasa final. Para los cultivos continuos, se observ ̤una reduccin̤ en la concentracin̤ de biomasa a bajas velocidades de dilucin̤. Finalmente, en el crecimiento fed-batch, no se produjeron ni esporas ni proten̕a cristal, an͠ cuando se redujera completamente el sustrato lm̕ite.Un profundo anl̀isis de los datos experimentales mostr ̤que el modelo cinťico de crecimiento cls̀ico no poda̕ predecir exactamente la concentracin̤ de biomasa para el intervalo de tiempo completo de un lote y a todas las velocidades de dilucin̤ de un cultivo continuo de B. thuringiensis. As,̕ se desarroll ̤y se prob ̤exitosamente un nuevo modelo de crecimiento cinťico con esporulacin̤, el cual incluye un třmino representando la velocidad especf̕ica de formacin̤ de esporas, para los datos experimentales batch y continuo.Los resultados experimentales fueron empleados tambiň para determinar parm̀etros cinťicos de crecimiento celular nuevos y confiables (μmax y Ks), as ̕como los coeficientes de rendimiento de crecimiento y velocidad de respiracin̤ para cultivos batch y continuos.